Western攻略:如何優化抗原和抗體的濃度

福建快三中奖助手官方 www.oiayb.com

每一個Western blot都涉及到抗原和抗體的相互作用,因此,抗體濃度并不是一成不變的,優化很重要。一抗和二抗濃度取決于每個抗體的特異性和抗原的特異性,以及樣品中存在的抗原量。每個廠家提供的二抗特異性也不同。在改變實驗參數,如更換了抗原、一抗、二抗或底物時,有必要重新優化。生物通 也許你要問,什么情況下需要優化抗原/抗體濃度呢?若Western blot出現了以下的結果,則你有必要找找原因,優化一下抗原/抗體的濃度。


• 信號弱

• 信號迅速地減弱
• 無信號,無背景

• 高背景,白色條帶
• 膜上出現橙色或棕色的點

• 非特異性條帶
• 彌散條帶

• 斑點狀背景


若是利用不同濃度的抗原或抗體,開展多次Western blot,也未嘗不可,但這也太耗時了。折騰兩下,一個星期就過去了。為此,賽默飛世爾旗下Pierce的專家介紹了一個簡便快速的斑點印跡(dot blot)方法。簡便快速的斑點印跡步驟
你要準備的材料

• 硝酸纖維素膜,剪成1 cm×8 cm的長條
• 包含抗原的樣品,以PBS、TBS或類似緩沖液稀釋

• 一抗和HRP結合的二抗
• 封閉液

• 洗滌液
• 底物工作液:HRP的化學發光底物(如SuperSignal底物)

• 膠片或CCD成像系統
 

操作步驟

1. 用TBS或PBS制備蛋白樣品的稀釋液。稀釋度要取決于樣品中存在的抗原濃度。由于抗原濃度通常未知,因此有必要檢測寬范圍的稀釋度。SuperSignal底物有著皮克至飛克水平的檢測靈敏度。因此樣品稀釋可以在微克至飛克范圍。
2. 制備硝酸纖維素膜,用鉛筆標上每個待測一抗/二抗的濃度。所需轉印膜的數量取決于待篩查的一抗和/或二抗有多少種不同的稀釋濃度。通常來說,一抗要檢測一到兩個稀釋度,而二抗要檢測兩到三個稀釋度。例如:使用SuperSignal底物,一抗和二抗可如下稀釋:

   1/1000的一抗和1/50000的二抗
    1/1000的一抗和1/100000的二抗

     1/5000的一抗和1/50000的二抗
    1/5000的一抗和1/100000的二抗

3. 將硝酸纖維素膜放在濾紙上。將抗原稀釋液點在膜上。每個點的體積越少越好(1-5μl),以保證點盡可能地小。如果需要使用5μl以上的樣品,在點完一次后,干燥2-5分鐘,再點一次。讓膜干燥10-15分鐘,或直至無可見水分。
4. 用封閉液封閉膜上的非特異性位點,室溫震蕩孵育1 h。

5. 用包含1/10體積封閉液的洗滌液稀釋一抗,并加到膜上,室溫震蕩孵育1h。
6. 用洗滌液洗膜4次,每次5分鐘,用盡可能大體積的洗脫液。

7. 用包含1/10體積封閉液的洗滌液稀釋二抗,并加到膜上,室溫震蕩孵育1h。
8. 用洗滌液洗膜4次,每次5分鐘,用盡可能大體積的洗脫液。

9. 準備底物工作液,將等體積的SuperSignal Substrate Luminol/Enhancer溶液與過氧化物溶液混合。制備足夠體積的工作液,以確保印跡點完全濕潤,且印跡點在孵育過程中不會干。建議體積:0.125 ml/cm2印跡。
10. 將膜放在底物工作液中孵育5分鐘。

11. 將膜取出,放在塑料布或其它防護膜上。
12. 蛋白一側朝上,將印跡貼到膠片上,曝光30-60秒。為獲得最佳結果,曝光時間可能不同。如果第一次曝光不夠,再試試2-5分鐘。另外,也可用CCD相機或其它成像儀。

13. 在一張優化好的印跡膜上,底物產生的信號可能會持續6-24小時,這取決于具體的產品。若結果不佳,可重新曝光。隨印跡時間的延長,可能需延長曝光時間。如果仍未獲得最佳結果,可用不同濃度的抗原和/或抗體重復以上步驟。