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我最近听到一个故事,说有人想用“高帅富”的二代测序检测乳腺癌MCF-7细胞里基因Pim3的表达量,有所震惊,“高射炮打蚊子”的节奏?!也不知道是哪位小伙伴老板这么有钱,倘诺老板懂那么点基础实验,定会打烂各位的屁股。
 

  据说这位童鞋得到老板的5字箴言——“做个预实验”,老板就是老板,绝不跟你多说一个字的废话,剩下的自己研究。于是这位童鞋首先打算检测乳腺癌MCF-7细胞里基因Pim3的表达量,这也是小伙伴们在预实验经常面临的。

 

  最初他打算用qPCR检测细胞内mRNA的表达量,qPCR有两化学方法——探针法和染料法,这位童鞋选择的是相对便宜的SYBR green染料法。

 

 

  但是偏有好事之徒指点江山,“为啥要做SYBR green染料法的qPCR呢?要做定量qPCR的话,不如做Taqman探针法的qPCR来得精确。有文章介绍过,SYBR green来做qPCR的话,是会有很严重问题的。因为SYBR green会抑制PCR反应,得出来的结果没有探针来的效果好,其实价钱也没差很多!”

 

  这位临床高手+实验室菜鸟,在他人的建议之下,开始转向研究Taqman探针,好不容易摸出点门道,准备将Taqman探针发给公司合成。实验室又出现另一个“好事之徒”,建议其直接检测乳腺癌MCF-7细胞系Pim3蛋白表达量,理由如下:mRNA表达降低,并不代表蛋白表达会降低呢,因为如果蛋白的泛素化停滞,蛋白就会累积;又或者蛋白的磷酸化不断激活,也会导致蛋白作用的变化。所以用Taqman探针还不如用Western Blot来得直接,直接检测蛋白表达、磷酸化、泛素化的变化,以防后患??固宓募矍簿捅萒aqman探针贵了那么一点而己。

 

  这位童鞋实验本就是七窍通了六窍,觉得也是嘛有道理的,于是忽忽悠悠地就查了各种抗体的供应商,你懂的,对于入门菜鸟,要研究会Western也不是容易的事情。你认为这就结束了?
 

  说来话巧,造化弄人,又来一位指点江山的师兄,“你要研究基因表达变化,干嘛不就做一张芯片呢?一下子就出来全部基因组里的表达变化,多好!想要啥就有啥,里面2w多个基因随你挑!跟这个基因表达相关的上下游通路,啥都一清二楚,绝对是居家旅行,沉默表达必备的利器??!价钱么也就比抗体贵一点点,少定几个抗体就都有了,多划算呢!”

 

  此后几周,这位童鞋找了几家芯片公司,好好地恶补什么是mRNA芯片、miRNA芯片、LNC RNA芯片。最后这位同学找到了华大基因准备做二代测序,究其原因,有人告诉他,芯片这种东西已经过时了,完全跟不上现在时代的套路了,要做就做二代测序。

 

  这个故事固然离奇,但是“高射炮打蚊子”这种事情,干过的小伙伴可以默默地举个手!

 

老谈闲谈:


这位童鞋有以下几点误区:
 

1、SYBRGreen在高浓度情况下会抑制PCR反应,但普通的qPCR 2×Mix是不会出现这样的情况;

 

2、蛋白的检测确实可以说明表达的问题,泛素化、磷酸化也能检测蛋白的作用,其实检测mRNA也能解决大部分的表达问题,蛋白表达一般是在mRNA表达差异不明显的情况下再使用的; 

 

3、芯片是高大上的,但单基因变化,完全用不上基因芯片,而且在做基因芯片之前,也需要在有表达差异的细胞或者组织间进行;

 

4、二代测序是更高大上的技术,深度测序可以了解低频的突变,转录本的测序可以了解细胞组织的整体的表达情况,要是你只是检测单基因完全没必要搞得那么复杂;

 

5、当实验室的师兄,特别是表面上很有科研能力的师兄怂恿你用新技术的时候,请千万要三思而行,自己思考一下才会省去很多不必要的麻烦;

 

6、记得给老板省点钱,不然小伙伴们不好交差,倘诺自己是老板的小伙伴,自己的经费更要省着花才对。

 

 文章来源:Helixlife