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我最近聽到一個故事,說有人想用“高帥富”的二代測序檢測乳腺癌MCF-7細胞里基因Pim3的表達量,有所震驚,“高射炮打蚊子”的節奏?!也不知道是哪位小伙伴老板這么有錢,倘諾老板懂那么點基礎實驗,定會打爛各位的屁股。
 

  據說這位童鞋得到老板的5字箴言——“做個預實驗”,老板就是老板,絕不跟你多說一個字的廢話,剩下的自己研究。于是這位童鞋首先打算檢測乳腺癌MCF-7細胞里基因Pim3的表達量,這也是小伙伴們在預實驗經常面臨的。

 

  最初他打算用qPCR檢測細胞內mRNA的表達量,qPCR有兩化學方法——探針法和染料法,這位童鞋選擇的是相對便宜的SYBR green染料法。

 

 

  但是偏有好事之徒指點江山,“為啥要做SYBR green染料法的qPCR呢?要做定量qPCR的話,不如做Taqman探針法的qPCR來得精確。有文章介紹過,SYBR green來做qPCR的話,是會有很嚴重問題的。因為SYBR green會抑制PCR反應,得出來的結果沒有探針來的效果好,其實價錢也沒差很多!”

 

  這位臨床高手+實驗室菜鳥,在他人的建議之下,開始轉向研究Taqman探針,好不容易摸出點門道,準備將Taqman探針發給公司合成。實驗室又出現另一個“好事之徒”,建議其直接檢測乳腺癌MCF-7細胞系Pim3蛋白表達量,理由如下:mRNA表達降低,并不代表蛋白表達會降低呢,因為如果蛋白的泛素化停滯,蛋白就會累積;又或者蛋白的磷酸化不斷激活,也會導致蛋白作用的變化。所以用Taqman探針還不如用Western Blot來得直接,直接檢測蛋白表達、磷酸化、泛素化的變化,以防后患??固宓募矍簿捅萒aqman探針貴了那么一點而己。

 

  這位童鞋實驗本就是七竅通了六竅,覺得也是嘛有道理的,于是忽忽悠悠地就查了各種抗體的供應商,你懂的,對于入門菜鳥,要研究會Western也不是容易的事情。你認為這就結束了?
 

  說來話巧,造化弄人,又來一位指點江山的師兄,“你要研究基因表達變化,干嘛不就做一張芯片呢?一下子就出來全部基因組里的表達變化,多好!想要啥就有啥,里面2w多個基因隨你挑!跟這個基因表達相關的上下游通路,啥都一清二楚,絕對是居家旅行,沉默表達必備的利器??!價錢么也就比抗體貴一點點,少定幾個抗體就都有了,多劃算呢!”

 

  此后幾周,這位童鞋找了幾家芯片公司,好好地惡補什么是mRNA芯片、miRNA芯片、LNC RNA芯片。最后這位同學找到了華大基因準備做二代測序,究其原因,有人告訴他,芯片這種東西已經過時了,完全跟不上現在時代的套路了,要做就做二代測序。

 

  這個故事固然離奇,但是“高射炮打蚊子”這種事情,干過的小伙伴可以默默地舉個手!

 

老談閑談:


這位童鞋有以下幾點誤區:
 

1、SYBRGreen在高濃度情況下會抑制PCR反應,但普通的qPCR 2×Mix是不會出現這樣的情況;

 

2、蛋白的檢測確實可以說明表達的問題,泛素化、磷酸化也能檢測蛋白的作用,其實檢測mRNA也能解決大部分的表達問題,蛋白表達一般是在mRNA表達差異不明顯的情況下再使用的; 

 

3、芯片是高大上的,但單基因變化,完全用不上基因芯片,而且在做基因芯片之前,也需要在有表達差異的細胞或者組織間進行;

 

4、二代測序是更高大上的技術,深度測序可以了解低頻的突變,轉錄本的測序可以了解細胞組織的整體的表達情況,要是你只是檢測單基因完全沒必要搞得那么復雜;

 

5、當實驗室的師兄,特別是表面上很有科研能力的師兄慫恿你用新技術的時候,請千萬要三思而行,自己思考一下才會省去很多不必要的麻煩;

 

6、記得給老板省點錢,不然小伙伴們不好交差,倘諾自己是老板的小伙伴,自己的經費更要省著花才對。

 

 文章來源:Helixlife