同仁(DOJINDO) CCK-8試劑盒常見問答

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CCK-8試劑盒
500T
CK04
同仁
850
788
 
 
1.一個孔中應接種多少個細胞?

當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

 
2.能否用384孔板進行試驗?

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液,如果加入的CCK-8體積太少,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍,然后加入培養基體積20%的量。

 
3.能否用24孔板進行試驗?

可以。向各孔中加入培養基體積10%的CCK-8溶液。

 
4.酚紅會影響檢測嗎?

不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

 
5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性?

有。然而,請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同,因此結果可能不同。

 
6.CCK-8能否檢測細菌細胞?

可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細胞。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液,并培養1-4個小時或過夜。

 
7.CCK-8穩定嗎?

CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月,在-20℃下避光可以保存1年。如果需要長期保存,我們推薦-20℃的儲藏條件。

 
8.如果沒有450 nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?

還可使用450 nm到490 nm之間的濾光片。

 
9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?

可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

 
10.CCK-8是什么顏色?

應該是粉紅色。若顏色不一樣,有可能會影響測定。

 
11.CCK8能否對活細胞進行染色?

不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8),并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能對細胞進行染色。

 
12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒?

CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是,加到培養基中的CCK8是沒有毒性的,因為被稀釋了10倍。因此,長時間的培養,如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測,如結晶紫檢測,中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同,因此在需要進行長時間培養時,先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

 
13.在做加藥實驗時,藥物對測定是否有影響?如何解決?

有時會有影響。如果藥物具有還原性,會和CCK8發生顯色反應,增加吸光度。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK8,測定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (加CCK8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK8之前更換培養基,去掉藥物的影響。

 
14.每次測定的數值不一樣,是什么原因?如何解決?

可能會有以下幾個原因: 1. 當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。 一般情況下,最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK8后,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000個/孔范圍內摸索條件。

 
15.如何設定空白對照?

在不含細胞的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。

 
16.哪些物質會影響CCK8的測定?

當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定,例如含有維生素C的Glucose等 (一般培養基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。

 
17.在實驗中吸光度值太高,如果不能減少細胞數量,如何解決?

可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

 
18.設定參比波長的目的是什么?必須設定嗎?

不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

 
19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應該加多少量CCK-8試劑?

一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10。

 
20.在CCK-8顯色過程中,如何終止反應?

有一下幾種方法(96孔板): 1、 在顯色反應后,將培養板放置4℃冰箱內。 2、 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、 每孔加10 μl 1%(w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止后,應在24小時之內測定。

 
21.必須預培養細胞嗎?

不一定。如果要向保持細胞的最好狀態,建議預培養細胞。如果不做細胞預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

 
22.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑制。

 
23.CCK-8試劑的保存條件?

在避光條件下CCK-8試劑在4℃可保存一年。如果需要保存較長時間的話,推薦在-20℃下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結果,若經常使用可將試劑存放在4℃冰箱內保存。

 
24.預培養后,更換培養基需要細胞計數嗎?

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數盤計數,制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。

 
25.CCK-8對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?

不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

 
26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?

懸浮細胞由于染色比較困那,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

 
27.應該每次做標準曲線嗎?

建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣,對于狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對于不同的批號建議分別做標準曲線。

 
28.有時在藥物作用情況下,細胞已經死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。

 
29.實驗之前,是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應?

建議使用一個孔作一下檢測,因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質,在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。